是否目的基因在PCR擴增時不用在引物中加入酶切位點，就可與pGEM-T載體連接？為什么？

那要看你用什么方式構載體。如果用酶切連接的方式，可以直接酶切。如果用同源重組，應該是要PCR的

已經得到擴增的目的基因片段和克隆載體→對兩者分別進行酶切（選要相同的限制性內切酶對兩者進行切割）→酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳回收→克隆載體和目的基因進行連接（一般選用T4連接酶）→大腸桿菌感受態(tài)細胞的制...

應為PCR擴增出來的是混合物,酶切回收后才基本是純的目的片段. 載體一般不用PCR擴增,一般是質粒來源,也需要用切口一致的酶消化回收. 之后連起來就好了

理論上講PCR產物可以直接酶切連接反應。 但是，以PCR產物酶切的時候沒有辦法證明雙酶切是否成功、徹底（PCR產物會有ployA的存在必須切掉，但是PCR產物和酶切產物大小差別不大）。而以T載體為媒介...

你的問題有點難以理解。 PCR怎么做要看你的目的啊，如果從基因組中擴基因，連個鳥載體，當然是直接擴增。如果你要獲得全長序列，當然要載體，否則首尾的序列不可知。 至于“不加載體可以不加引物”就不知道你在...

不可以，高保真酶產物一般都是 平末端 。純化產物加taq酶，buffer和dNTP，72℃反應10~30分鐘即可加尾，產物就可以直接與 T載體 連接了。

普通的taq聚合酶會在PCR反應過程中在3’末端加入一個堿基A，線性化平末端T載體的兩端分別又人工加上一個額外的T堿基，從而可與PCR克隆產物的A末端互補配對，提高了PCR產物連接和克隆的效率。

我們用天根公司的膠回收試劑盒，回收目的基因及載體雙酶切后的產物用于連接，連接體系如下：一般載體1微升，目的基因8微升左右（沒.測OD）,用T4DNA連接酶（購于TaKaRa公司）1微升，再加酶緩沖液（...

這個問題的主要原因是PCR產物不容易被酶切。克隆到T載體后就可以很容易的進行酶切。這樣做起方便。

很顯然你的質粒沒有構建成功。感覺是連接出了問題，pBI121載體很大，回收比較困難，建議你測一下回收后的濃度。如果太低的話，建議加大酶切量。121載體至少應該達到50-100ng，然后再按1:3-10...