T4連接后對其質(zhì)粒PCR條帶不亮，為什么？酶切沒有條帶，是否連接上？

請問用的酶切位點是什么？可以考慮看看121載體上這兩個酶切位點是否靠在一起，而導(dǎo)致雙酶切效率降低~其次，如果你要測序，沒必要再切下來回收拿去測序，你可以直接送質(zhì)粒去測序，如果沒有通用引物，可以再載體設(shè)計一段測序引物以便測到你的目的片段。
最后想說的是，如果質(zhì)粒進(jìn)行PCR，模板不能加多了，你可以看看你0.8ul的時候，跑膠時能不能看到質(zhì)粒模板的帶，建議降低模板量，而不是增加（前提是提出的質(zhì)粒濃度正常）。一般PCR時，質(zhì)粒模板1ng-10ng就足夠了~

很顯然你的質(zhì)粒沒有構(gòu)建成功。感覺是連接出了問題，pBI121載體很大，回收比較困難，建議你測一下回收后的濃度。如果太低的話，建議加大酶切量。121載體至少應(yīng)該達(dá)到50-100ng，然后再按1:3-10摩爾比加入小片段.

至于PCR驗證出現(xiàn)假陽性，太正常了。還是酶切比較靠譜。

應(yīng)該是沒轉(zhuǎn)化成功，大腸桿菌空繁了，嘗試一下增加提高回收產(chǎn)物和T4連接酶的量。