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通過設(shè)計帶酶切位點(diǎn)的PCR引物來使目的片段添加限制性酶切位點(diǎn)的原理是什么？百思不得其解，請教各位！

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通過設(shè)計帶酶切位點(diǎn)的PCR引物來使目的片段添加限制性酶切位點(diǎn)的原理是什么？百思不得其解，請教各位！

2022-11-05 05:59

我的意思是說引物人為添加上的酶切位點(diǎn)與要擴(kuò)增的片段也不匹配，怎么能隨著引物克隆到目的片段上，而使目的片段帶上酶切位點(diǎn)的序列呢？原理是什么呢？
3個回答
2022-11-05 10:35
不是隨意添加。酶切位點(diǎn)都加在引物的5‘端。這樣在第一輪擴(kuò)增后，就會產(chǎn)生有酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物了(酶切位點(diǎn)在產(chǎn)物的兩端）。在接下來的擴(kuò)增中每個產(chǎn)物就都會有了。PCR的時候可以耐受引物的5‘端由數(shù)個不匹配的堿基對。但是隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，產(chǎn)物都有這些位點(diǎn)后，就不存在不匹配的問題了
2022-11-05 07:22
我要知道就好了
2022-11-05 06:53
大哥 我也沒想清楚，要是你知道了，跟我也說聲 什么原理??？
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基本上設(shè)計引物的時候用primer5看看就差不多了，沒有非特異沒有自身二級結(jié)構(gòu)，然后TM計算就是AT加2GC加4，加在一起就是TM退火溫度……不要有連續(xù)5個以上一樣的堿基，堿基分布均勻一些……就差不多...
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挑克隆鑒定時PCR有目的條帶但是酶切沒有
3個回答2022-09-06 01:47
2中可能，1種是你的抗生素失效了，長出來都是沒質(zhì)粒的菌；另1種是你轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)的都是空質(zhì)粒。 PCR擴(kuò)增有目的條帶可能是因為連接產(chǎn)物殘留的PCR片段在平板上引起的假陽性。
構(gòu)建載體雙酶切電泳后比目的片段pcr產(chǎn)物高
1個回答2022-10-27 20:41
可能是質(zhì)粒在轉(zhuǎn)菌后部分堿基出現(xiàn)錯配或者突變導(dǎo)致你酶切的位置發(fā)生變化.因為你pcr擴(kuò)增只是你引物的位置只要不突變就可以正常擴(kuò)增.建議你做個測序.
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1個回答2022-09-23 04:51
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