關(guān)于 克隆的問題。假如我有有一個(gè)基因片段,未知序列。我可以把它連接到T載體,然后PCR
PCR 用T載體PRIMER,然后測序,然后酶切出片段---------》從而達(dá)到得到很多此片段的目的。這個(gè)做法行么?或者別的做法,推薦下
3個(gè)回答
不行~
你得先用TAQ酶講這個(gè)片段過一個(gè)循環(huán)的PCR 這樣在后面加了A才可以連T載體 然后轉(zhuǎn)化涂板搖菌提質(zhì)粒測序
你得先用TAQ酶講這個(gè)片段過一個(gè)循環(huán)的PCR 這樣在后面加了A才可以連T載體 然后轉(zhuǎn)化涂板搖菌提質(zhì)粒測序
T載體分兩種。一種是末端帶有A的典型的T載體,這樣的T載體可以與taq酶擴(kuò)增出來的片段連接,另一種是平末端的T載體,這種T載體末端沒有A,它用于以pfu或者是phusion這樣的高/超保真酶擴(kuò)增出來的片段的連接,因?yàn)槟愕男蛄惺俏粗?,為保萬無一失,建議你最好先用taq給它處理下,即末端加A然后再和含有A的T載體連接,然后再用M13測序。
恩,你這是最簡單的方法了。大家都是這么做的。
相關(guān)問答
PCR擴(kuò)增的X基因片段與克隆載體連接
已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因片段和克隆載體→對(duì)兩者分別進(jìn)行酶切(選要相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)兩者進(jìn)行切割)→酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收→克隆載體和目的基因進(jìn)行連接(一般選用T4連接酶)→大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制...
全文求助,怎么克隆一段未知序列的基因
如果時(shí)間允許就先分離純化該酶蛋白,然后作質(zhì)譜分析其C端和N端序列,然后據(jù)此設(shè)計(jì)引物,克隆分析。 (轉(zhuǎn)載,僅供參考)
為什么基因測序前將基因PCR克隆后還要放到大腸桿菌載體上再測序?
補(bǔ)充一個(gè)更重要和實(shí)際的考慮:實(shí)際測序中,可靠的測序結(jié)果往往是從引物后二三十個(gè)堿基才開始的。如果片段比較長,超過一次測序能力如七八百之外,即使雙向測序也無法獲得引物(排除非特異擴(kuò)增)或緊鄰引物處的序列時(shí)...
全文為什么基因測序前將基因PCR克隆后還要放到大腸桿菌
大腸桿菌是一種載體,要是因?yàn)闇y序的原因,獲得的全長序列要經(jīng)過測序驗(yàn)證,而目前的測序技術(shù)有限,在序列的起始端準(zhǔn)確性不高,所以想要獲得準(zhǔn)確的全長序列就需要克隆到載體上。具體可以了解一下測序的原理。
克隆測序和PCR產(chǎn)物直接測序有哪些不一樣
眾所周知PCR壙增程現(xiàn)錯(cuò)配現(xiàn)象能所錯(cuò)配都發(fā)同位置PCR片段直接測序其結(jié)PCR片段眾混合物結(jié)某點(diǎn)現(xiàn)幾十錯(cuò)配現(xiàn)象數(shù) (或許幾十萬)點(diǎn)應(yīng)該確測序錯(cuò)配現(xiàn)象反映 PCR片段直接測序結(jié)反映PCR用模板原始結(jié)PCR...
全文為什么pcr產(chǎn)物可以直接連t載體
普通的taq聚合酶會(huì)在PCR反應(yīng)過程中在3’末端加入一個(gè)堿基A,線性化平末端T載體的兩端分別又人工加上一個(gè)額外的T堿基,從而可與PCR克隆產(chǎn)物的A末端互補(bǔ)配對(duì),提高了PCR產(chǎn)物連接和克隆的效率。
T載體的作用是什么?克隆時(shí)為什么要用T載體?
我做過幾個(gè)克隆,沒用過T載體,直接將酶切后純化的產(chǎn)物進(jìn)行連接,照樣可以連接成功,基本上都會(huì)有10-50個(gè)克隆長出來。我用的是Sal I和Nde I這兩個(gè)酶切位點(diǎn),似乎這兩個(gè)都是平端的哦。
基因克隆載體連接步驟
基因克隆的步驟: 1、獲取目的基因; 2、將目的基因與載體連接; 3、重組體載入受體細(xì)胞; 4、重組體的篩選、克隆。 具體到載體連接這一步,將酶切后的載體與目的片段加入相應(yīng)的連接體系中就可以了。
請(qǐng)問PCR產(chǎn)物直接測序和克隆后再測序有什么區(qū)別,用PCR產(chǎn)物直接測序不是更省時(shí)間嗎,省得再連到載體上了啊
PCR產(chǎn)物直接測序,引物端約有幾十個(gè)堿基是測不出來的,如果你恰好關(guān)注這個(gè)位置,那么或者從另一端測通(你的產(chǎn)物不長),或者克隆測序 此外,很多時(shí)候由于PCR產(chǎn)物不專一,直接測序效果不好,而克隆測序沒這個(gè)...
全文PCR的目的片段與載體連接的目的是什么?
那得看你用多少濃度的膠跑,如果用1%的瓊脂糖電泳30min,你的主帶(超螺旋的閉環(huán)質(zhì)粒dna)會(huì)在3kb-2kbmarker之間,如果是單酶切產(chǎn)物,則應(yīng)該在3.5kb的marker附近。
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