為什么基因鏈接好做完轉(zhuǎn)化之后長出來的菌落做PCR驗(yàn)證沒有結(jié)果呢，擴(kuò)增不出來？

已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因片段和克隆載體→對(duì)兩者分別進(jìn)行酶切（選要相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)兩者進(jìn)行切割）→酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收→克隆載體和目的基因進(jìn)行連接（一般選用T4連接酶）→大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制...

你的問題有點(diǎn)難以理解。 PCR怎么做要看你的目的啊，如果從基因組中擴(kuò)基因，連個(gè)鳥載體，當(dāng)然是直接擴(kuò)增。如果你要獲得全長序列，當(dāng)然要載體，否則首尾的序列不可知。 至于“不加載體可以不加引物”就不知道你在...

設(shè)計(jì)一對(duì)引物，針對(duì)基因兩端（覆蓋酶切位點(diǎn)），在上游引物中酶切位點(diǎn)后的一段序列中添加一個(gè)堿基，擴(kuò)增以后，酶切產(chǎn)物和空載體，再連接一遍，轉(zhuǎn)化，小提拿去測序。 最好上游換另一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，這樣方便雙酶切檢測...

沒連進(jìn)去唄 可能是最初的PCR就沒擴(kuò)增出來你要的條帶 調(diào)整下退火溫度 或者直接連T載體測序 或者換對(duì)引物

設(shè)計(jì)一對(duì)引物，針對(duì)基因兩端（覆蓋酶切位點(diǎn)），在上游引物中酶切位點(diǎn)后的一段序列中添加一個(gè)堿基，擴(kuò)增以后，酶切產(chǎn)物和空載體，再連接一遍，轉(zhuǎn)化，小提拿去測序。 最好上游換另一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，這樣方便雙酶切檢測...

那要看你用什么方式構(gòu)載體。如果用酶切連接的方式，可以直接酶切。如果用同源重組，應(yīng)該是要PCR的

你做完菌落PCR以后，電泳完要看看是不是你需要的那一條帶，如果這條帶是你要的話，你就要拿你用來菌落PCR的菌液拿去測序就可以了，因?yàn)槲移綍r(shí)也是做菌落PCR，而且提取質(zhì)粒是檢測不出來的，但是菌落PCR以...

試劑盒用起來比較方便，具體還要看自己做的樣本來定

C

不用的，因?yàn)槟鉖CR的時(shí)候加的 Tag酶，在擴(kuò)增過程中它會(huì)在末端加上A... T vector就會(huì)與A結(jié)合了 你可以在下一步步驟中，選擇酶切位點(diǎn)去剪切后 再與你的目的載體連接。