外源基因在大腸桿菌中的表達問題

生物體對密碼子的偏愛性：
不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白編碼基因，對于同一氨基酸所對應的簡并密碼子，使用頻率并不相同，也就是說生物體基因對簡并密碼子的選擇具有一定的偏愛性。決定這種偏愛性的因素有三：
A. 生物基因組中的堿基含量
在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高，而在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢。
B. 密碼子與反密碼子相互作用的自由能適中的作用強度最有利于蛋白質生物合成的迅速進行；弱配對作用可能使氨酰基tRNA分子進入核糖體A位需要總費更多的時間；而強配對作用則可能使轉肽后核糖體在P位逐出空載tRNA分子耗費更多的時間。
如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；
如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
C. 細胞內tRNA的含量。
②密碼子偏愛性對外源基因表達的影響
由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有不同程度的差異性，因此，外源基因尤其是哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：
A. 外源基因全合成
B. 同步表達相關tRNA編碼基因
2．載體的選擇
所用表達載體必須是大腸桿菌表達載體，含有大腸桿菌RNA聚合酶所能識別的啟動子（如PL、tac、T7等）和SD序列。
(1)核糖體結合位點
外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘ 端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）
(2)大腸桿菌核糖體結合位點的特征
位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3’端區(qū)域3’ AUUCCUCC 5’并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；